使用點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)原生質(zhì)體：熒光染料組合

關(guān)鍵詞：自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)、原生質(zhì)體分離、原生質(zhì)體活性評(píng)估、雙重染色、染料評(píng)估

1 引言

原生質(zhì)體是通過酶解或機(jī)械方法去除細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。這些無細(xì)胞壁的球形植物細(xì)胞具有獨(dú)特特性，使其成為植物科學(xué)研究的多功能工具。它們可作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可用于探索植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、化學(xué)特性及功能。

傳統(tǒng)活力評(píng)估需將原生質(zhì)體培養(yǎng)至發(fā)育成完整植株，但該方法無法實(shí)現(xiàn)即時(shí)的活力評(píng)估。點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀用不同顏色的熒光染料，通過雙重染色法快速測(cè)定活力，但需了解該設(shè)備在不同染料條件下的表現(xiàn)并調(diào)整分析參數(shù)。本研究旨在確定使用點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀評(píng)估原生質(zhì)體活力的染料組合及參數(shù)設(shè)置。

2 原生質(zhì)體分離與染色

2.1 原生質(zhì)體分離步驟

1. 準(zhǔn)備5克幼苗，依次用乙醇和蒸餾水各清洗1次和2次。

2. 用紙巾吸干水分后置于培養(yǎng)皿中，用剪刀細(xì)切。

3. 加入25ml消化緩沖液混勻，轉(zhuǎn)移至50ml離心管并用錫箔紙遮蓋避光。

4. 置于搖床上以20轉(zhuǎn)/每分鐘轉(zhuǎn)速培養(yǎng)6小時(shí)。

5. 培養(yǎng)后加入20ml洗滌緩沖液，輕輕混勻后經(jīng)100 μm濾網(wǎng)過濾。

6. 100 g離心3分鐘。

7. 去除上清液，加20ml洗滌緩沖液混勻后經(jīng)40 μm濾網(wǎng)過濾。

8. 再次100 g離心3分鐘。

9. 去除上清液，用3ml洗滌緩沖液重懸沉淀。

2.2 熒光染色步驟

1. 混合：

l18 μL原生質(zhì)體細(xì)胞

l2 μL綠/紅熒光染料等體積混合液

2. 取10 μL染色細(xì)胞懸液樣本上樣

3. 使用點(diǎn)成LUNA-FX7™進(jìn)行分析。

* 注意：原生質(zhì)體尺寸差異大，可能表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度。請(qǐng)根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。

表1：點(diǎn)成LUNA-FX7™熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)模式下原生質(zhì)體計(jì)數(shù)的建議參數(shù)

3 用于活性測(cè)定的熒光染料

我們選用了五種常用熒光染料進(jìn)行活力評(píng)估：

4 原生質(zhì)體活力評(píng)估的熒光染料組合

FDA/PI或FDA/EthD-1是原生質(zhì)體活力評(píng)估的選擇（圖1）。PI和EthD-1均能有效染色原生質(zhì)體核，但需要將紅光曝光水平調(diào)至9才能檢測(cè)到充足信號(hào)（表1）。

在測(cè)試的綠色熒光染料中，僅FDA無需調(diào)整綠光曝光水平即可產(chǎn)生明亮可靠的信號(hào)。FDA和Calcein AM雖均依賴酯酶活性產(chǎn)生信號(hào)，但Calcein AM幾乎無信號(hào)響應(yīng)。需特別注意的是，FDA在持久培養(yǎng)時(shí)間中可能產(chǎn)生較高的背景噪音，建議在染色后立即進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以獲得活力評(píng)估結(jié)果。如果信號(hào)過強(qiáng)，可以通過調(diào)整綠光曝光水平進(jìn)行優(yōu)化。此外，盡管AO通常被認(rèn)為能染色所有細(xì)胞，但其熒光強(qiáng)度顯著降低。

圖 1：分離原生質(zhì)體的染色結(jié)果。原生質(zhì)體經(jīng)FDA/PI或FDA/EthD-1染色效果較好，而AO/PI或EthD-1、Calcein AM/PI或EthD-1均未顯示綠色信號(hào)。

FL：綠色和紅色熒光通道合并圖像。

Tag：所有通道（熒光和明場(chǎng)）合成圖像，檢測(cè)目標(biāo)以紅/綠圈標(biāo)記，紅圈表示死細(xì)胞，綠圈表示活細(xì)胞。

5 緩沖液對(duì)綠色熒光染料性能的影響

盡管AO能夠染色所有細(xì)胞（無論死活），但其在原生質(zhì)體中低信號(hào)異常促使我們進(jìn)一步研究。我們在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如U937細(xì)胞）上使用綠色染料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并使用PBS或洗滌培養(yǎng)基作為緩沖液，采用默認(rèn)分析方案評(píng)估緩沖液對(duì)染料信號(hào)的影響。結(jié)果顯示：AO信號(hào)強(qiáng)度在洗滌緩沖液中較PBS顯著降低（圖2A）；Calcein AM在洗滌緩沖液中信號(hào)穩(wěn)定性提升，FDA信號(hào)受緩沖液類型影響較小，僅強(qiáng)度輕微下降（圖2B和圖2C）

導(dǎo)致這些差異的具體因素尚不明確，但緩沖液的滲透壓和pH值差異可能會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)和染料性能。例如，AO在不同pH值下可能顯示不同顏色。而滲透壓的差異會(huì)使細(xì)胞大小從13 µm左右縮小至1-2 µm。綜合考慮這些因素，化學(xué)條件的變化可能通過多種機(jī)制影響染料表現(xiàn)。

圖2 不同緩沖液對(duì)AO（A）、Calcein AM（B）及FDA（C）在U937細(xì)胞中染色性能的影響。AO信號(hào)在洗滌培養(yǎng)基中減弱，Calcein AM性能改善，F(xiàn)DA則無明顯變化。

BF：明場(chǎng)圖像

FL-Tag：熒光通道合并圖像，檢測(cè)目標(biāo)以紅/綠圈標(biāo)記。紅色圓圈表示死細(xì)胞，綠色圓圈表示活細(xì)胞。

6 結(jié)論

FDA/PI或DA/EthD-1是原生質(zhì)體染色活力評(píng)估組合。FDA始終產(chǎn)生可靠的信號(hào)，但應(yīng)在染色后立即進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以盡量減少培養(yǎng)期間的噪音。Calcein AM的性能因細(xì)胞類型和緩沖液而異。值得注意的是，AO信號(hào)在洗滌培養(yǎng)基中顯著降低。此外，PI和EthD-1對(duì)原生質(zhì)體的染色效果良好，但需將紅光曝光水平從5調(diào)至9。總之，點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀通過優(yōu)化染料組合與分析參數(shù)，可為原生質(zhì)體活力評(píng)估提供高效解決方案。