1 引言

現代細胞計數儀采用自動化方法對特定濃度范圍內的細胞進行計數。高濃度的上限受限于準確區分細胞邊界的能力，而低濃度的下限則由攝像頭視場（FOV）等因素決定。然而，當圖像中只有少量可辨別的細胞或特征時，自動聚焦失敗可能會影響細胞計數性能，導致較高的變異系數（CV）。在細胞濃度足夠的常規細胞培養過程中，這通常是一個次要問題，但在如細胞治療產品制造初期種子培養階段的極低濃度樣本中，這一問題則顯得尤為關鍵。在此類情況下，獲得清晰圖像對于實現準確細胞計數至關重要。為了解決這一問題，我們開發了一種新型自動聚焦算法，通過*技術精確識別圖像特征。本技術說明討論了LUNA-FX7™軟件（1.9.1及以上版本）中針對極低濃度優化的最新更新，同時展示了LUNA-FX7™自動細胞計數儀的性能。

2 LUNA-FX7™的自動聚焦過程

LUNA-FX7™系統采用基于圖像對比度的自動聚焦算法。該自動聚焦過程由粗略掃描和精細掃描組成，確保LUNA-FX7™系統的最佳聚焦性能（圖1）。其首先通過粗略掃描在廣泛的Z平面范圍內采集圖像，以覆蓋較大的景深。在此過程中，算法確定一個大致的焦平面。隨后，進行精細掃描，專注于更窄的Z平面范圍，精確確定最佳焦平面。此過程基于圖像特征，保證了LUNA-FX7™系統的最佳聚焦性能。

圖1. 圖示LUNA-FX7™系統自動聚焦過程的工作流程，包括粗略掃描和精細掃描

自動聚焦的挑戰

依賴圖像對比度的自動聚焦算法在僅有少量目標物體或特征較少的情況下，可能難以準確確定適合的聚焦位置。在粗略掃描階段，這一問題尤為明顯，系統可能難以識別合適的Z平面，導致后續精細掃描中聚焦失敗（圖2A）。為了解決這些挑戰，我們開發了一種新算法，以增強在低細胞濃度或圖像特征有限條件下的目標物體識別能力（圖2B）。該改進算法提高了自動聚焦過程的精確性和可靠性，在復雜場景中提供更精確和一致的結果。

圖2. 不同算法在聚焦中的表現。(A) 算法1未能找到焦點，導致圖像模糊不清 (B) 算法2成功識別合適的聚焦位置，圖像清晰銳利

改進的自動聚焦性能

為驗證新開發的自動聚焦算法的有效性，我們通過使用相同樣本對LUNA-FX7™系統的不同軟件版本進行了對比實驗。結果證實，新自動聚焦算法的性能有顯著提升。這一顯著改進通過采用組合方法增強了目標檢測的靈敏度，實現了所有視場中更精確和可靠的聚焦位置（圖3）。即使在每張圖像中目標物體少于五個的極低細胞濃度下，升級后的算法仍能實現精確的聚焦位置，表現出一致的準確性。

圖3. 將U937細胞稀釋至2.54 x 10?細胞/mL的濃度，使每張圖像中目標物體少于5個。顯示完整的12個視場。算法2能有效檢測和識別目標物體(A)，而算法1未能實現理想聚焦(B)

結論

LUNA-FX7™系統在極低細胞濃度下提供了準確的細胞計數。通過采用增強目標檢測靈敏度的組合方法，我們改進的自動聚焦算法顯著提升了性能。在目標物體或特征有限的情況下，該算法能夠準確識別聚焦位置。這些改進使LUNA-FX7™系統在復雜條件下成為可靠且高效的細胞計數解決方案。新型自動聚焦算法已應用于LUNA-FX7™ 1.9.1版本及以上的軟件中。